1.生体高分子による氷の結晶成長の制御機構の研究

　極地の海氷に覆われた海に住む魚は、血液が融点より低くなった状態（過冷却状態）でも、凍結することなく生命活動を維持しています。このような寒冷な環境で、生き物が生存していくためには、どんな戦略があるのでしょうか？この問題は、地球の寒冷圏の環境と生命圏とを結び付ける、最も基本的で重要な課題です。特に、極海に住む魚の場合には、彼らの血液中に含まれる極微量の特殊なタンパク質（不凍タンパク質と呼ばれます）が、大きな役割を果たしていることが知られています。

このタンパク質は、結晶成長する氷の界面に吸着することで結晶の成長を制御する機能を持つため、生体の凍結を防止できると考えられています。しかしながら、どのような仕組みで氷の成長が制御されるのか、あるいは氷の核生成には作用しないのだろうかなど、氷の結晶成長ダイナミクスに与える効果については、未だに十分な理解が得られていません。これは、氷の結晶成長の詳細な観察や氷と水の界面の構造を分子のレベル調べることが非常に難しいことに大きな原因がありました。

私たちは、このような特殊なタンパク質分子が氷の界面に吸着どの様な吸着を起こすのか、そしてそれが氷結晶の成長ダイナミクスにどのような効果を持つのかを、さまざまな研究手段を使って解明しようとしています。たとえば、不凍タンパク質分子に蛍光を発する分子をマーカーとして取り付け、不凍タンパク質が結晶の成長界面でどの様な挙動をするのかを可視化することが可能です。私たちは、実際に不凍タンパク質が一切に界面に吸着する過程やそれが結晶の成長速度の変化と密接に関連していることを世界で初めて直接観察することに成功しました。

　このようなタンパク質は、最近になってある種の昆虫や植物などにも含まれていることが明らかになってきました。すなわち、タンパク質の作用による生体の凍結抑制機構は、寒冷環境における生物に普遍的に見られる戦略である可能性があります。このため、今後の研究の進展が期待されています。

　また、この問題はタンパク質分子などの巨大な生体高分子が、さまざまな結晶の成長を制御するという先端科学の分野とも関連が深いものです。たとえば、貝殻や骨など生体内で生成する結晶体は、その成長や形が生体高分子により制御されると考えられます。これは、バイオミネラリゼーションと呼ばれる最新の研究分野で、新材料の創製などにも応用が期待されています。氷の成長に対する不凍タンパク質の効果の研究は、この分野の基礎をになう研究としても注目されています。

2.氷結晶の形態不安定化に関する宇宙実験

　冷蔵庫の中で水を冷やすと、雪の結晶と同様に六方対称の発達した美しい樹枝状結晶が生じます。この結晶がどのようなしくみで美しい形を作るのかは、非常に興味深い問題です。しかしながら、地上では重力の影響により、結晶の周囲に熱対流が生じますので、結晶の形が不均等になったり対称性が破れたりして、実験の精度を上げることが大変困難になります。この効果を避けるためには、重力の影響がない環境で実験を行うことが重要になります。私たちは、地上400キロの宇宙空間を飛行している国際宇宙ステーション「きぼう」の内部で実現される微小重力環境（無重力環境）を利用して、氷の結晶成長実験を実施しています。
　「きぼう」での最初に実験は、2008年11月にNASAのケネディスペースセンターからスペースシャトルエンデバーによって打ち上げられ、「きぼう」に運ばれた実験装置を使い、約3ヶ月にわたって実施されました。
　この実験では、さまざまな過冷却温度で130回を越える氷の結晶成長に成功し、地上での実験では得られない多くの貴重なデータを取得しました。実験の詳細については、以下のHPをご覧ください。
http://kibo.jaxa.jp/experiment/theme/first/ice_crystal_start.html
また、この宇宙実験のために開発された装置についての説明は、下記のHPにあります。
http://microscopelabo.jp/trend/008/

　一方、2回目の氷の結晶の宇宙実験の計画も進行中です。これは、不凍糖タンパク質と呼ばれる特殊なタンパク質を含む水溶液を冷却して、その中で氷の結晶成長の様子を詳細に観察しようというものです。現在のところ、日本のHTVロケット3号機に搭載され、2011年の末ごろに｢きぼう｣に向けて打ち上げられる予定です。｢きぼう｣での実験の実施は、翌年になる予定です。実験の概要については、以下のHPに説明があります。
http://kibo.jaxa.jp/experiment/application/pm02pick.html

3.高分解光学系を用いた氷結晶表面の分子レベル直接観察

　中谷宇吉郎博士が人工雪の成長に初めて成功して以来(1936年)，低温科学研究所では，雪・氷結晶について多くの先駆的な研究が行われてきました．しかしこれまでの研究では，雪・氷結晶表面上のステップなどの分子高さレベルの表面モルフォロジーについては，実験的にアプローチすることが出来ませんでした．そのため，雪・氷結晶の成長や融解に関しては，結晶表面は空間的に平均化されたブラックボックスとして扱われざるを得ませんでした．
　そのような状況を打破するべく，様々な高分解光学顕微技術を開発し，雪・氷結晶表面上の分子高さのモルフォロジーやその時間発展の直接追跡に挑んでいます．その結果，これまでに下記の様な成果を得ています．

3.1. 空気−氷結晶界面での「単位ステップ」の運動の直接光学観察
　氷以外の結晶では，その表面上で結晶を形作る大本となる分子層の成長端（単位ステップ）（注１）は様々な方法でよく観察されてきました．しかし，氷結晶の場合には，単位ステップを結晶の成長中に可視化することはこれまでだれも出来なかったため，相転移や多くの物理的・化学的過程のメカニズムは想像されるにとどまっていました．
　これまでにオリンパスと共同で開発したレーザー共焦点微分干渉顕微鏡（後述）に，その性能を極限まで引き出すべくさらに様々な改良を加えました．そして，水蒸気中で成長させた氷結晶（雪結晶と同じ）の表面を，この光学顕微鏡を用いて観察しました．
　その結果の一例を図１に示します．氷結晶の六角底面上で，２次元島状の分子層が多数出現し，それらが横方向に成長し広がることで結晶が成長する様子が観察出来ました（図１：ムービーはこちら）．隣り合った分子層が合体する際にその縁（ステップ）のコントラストが完全に消滅することは（図１中の＋印），隣り合った分子層の厚みが等しいことを示します．分子層の合体に伴うステップコントラストの消滅が結晶表面上のいたるところで常に観察されることより，可視化した分子層は，結晶構造より決まる最小の厚みを持った単位ステップ（0.37 nm厚み）であることが証明されます．また，氷結晶の側面上（図２：ムービーはこちら）でも同様に単位ステップが観察できました．さらに，結晶が渦巻成長する様子の観察にも成功しています．本研究により，氷結晶が成長する様子を初めて分子レベルで追跡することが可能になりました．
　これにより，氷結晶の結晶成長・溶解の機構を根源的に理解できるようになると期待しています．また，氷の表面融解などの現象と表面モルフォロジーとの相関も明らかにすることができるかもしれません．
本成果の詳細：G. Sazaki, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 107, 19702-19707 (2010).
および佐崎の個人ページまで

図１　氷結晶の六角底面上で，２次元島状の分子層（0.37Å厚み）が多数出現し，それらが横方向に広がることで結晶が成長する様子．画像は0.57秒ごとに撮影されています．隣り合った分子層が合体すると，互いの厚みが等しいため，分子層の縁（ステップ）のコントラストが完全に消滅する（図中＋印）ことがわかります． （ムービーはこちら: 86MB）

図２　氷結晶の側面上で２次元島状の分子層が成長する様子．画像は0.99秒ごとに撮影されています．隣り合った分子層が合体すると，互いの厚みが等しいため，分子層の縁（ステップ）のコントラストが完全に消滅します（図中＋印）． （ムービーはこちら: 66MB）

注と図３　結晶はブロックを１つ１つ積み上げる様に，分子を１つ１つ積み上げることで成長します．また，分子を積み上げる際には，右図の様に分子層の端（単位ステップ）に分子（赤色）が組み込まれ，単位ステップが横方向に成長することで，１層づつ層状に成長してゆきます．このように結晶が成長する大本となる単位ステップの厚みは，分子の大きさと結晶構造から１つに定まります．

3.2. 氷の新しい融け方を発見：２種類の異なる表面液体相の生成
　氷結晶の表面は融点（0℃）以下の温度でも融解し，表面液体相（疑似液体層）が生成します．表面液体相は，スケートの滑りやすさや復氷，霜柱による凍上，氷結晶粒の再結晶化や粗大化，雪結晶の形の変化，食品や臓器の低温保存，雷雲での電気の発生など，幅広い現象の鍵を握ると考えられています．そのため，これらの現象の秘密を解き明かすためには，表面液体相の正体を分子レベルで解明する必要があります．融点以下での氷の融解による表面液体相の生成は，電磁気学の祖であるマイケル・ファラデーによって1850年代に初めて提唱されましたが，これまで誰も直接可視化することが出来ませんでした．
　オリンパス株式会社と共同で開発したレーザー共焦点微分干渉顕微鏡を用いて，水蒸気中で成長させた氷結晶（雪結晶）の表面を観察しました．氷結晶の六角底面上で，あたかも水と油の様に互いに混じり合わない２種類の表面液体相が生成することを発見しました（図４）．-1.5℃より低い温度では氷結晶の表面は成長してゆきますが，-1.5〜-0.4℃よりも高い温度ではバルク状の液滴（α相：図４の白三角）が，そして-1.0〜-0.1℃よりも高い温度では薄い液状の層（β相：図４の赤三角）が生成します．これらの形状の違いは，２つの表面液体相の物理的・化学的性質が大きく異なることを示しています．２種類の表面液体相は，氷の結晶表面上を動き回り，合体を繰り返します．これまでは，表面液体相は１種類しか存在せず，氷の全表面から一様に生成すると考えられてきました．しかし，本研究により，２種類の表面液体相が存在し，それらは氷の表面上で極めて不均一かつダイナミックな振る舞いをすることがわかりました．
　水と油は性質が全く異なる分子より出来ているため互いに混ざり合いません．しかし，同じ水分子から出来ている２種類の表面液体相が互いに混ざり合わず，あたかも水面上に雨粒が乗った様な振る舞いを示すことは（図４），基礎科学の観点から極めて興味深い現象です．
　本研究により得られた表面液体相についての新たな描像は，スケートの滑りやすさから雷雲での電気の発生まで，表面液体相が重要な役割を果たす幅広い現象の秘密を解き明かす鍵を握ると期待されます．
（本研究の詳細：G. Sazaki, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 109, 1052-1055 (2012).）
および佐崎の個人ページまで

図４　氷結晶の六角底面上で生成する２種類の表面液体相。図の左側は光学顕微鏡写真で，右側は模式図です。α相（白三角）とβ相（赤三角）の発生温度は実験のたびに若干のずれを示しましたが，同じ実験中では常に?相は?相よりも高温で発生しました。黒三角は氷結晶表面上の水１分子高さの分子層（単位ステップ）を示しています。（ムービーはこちら [avi:1.4M]）

 

3.3. 高分解光学その場観察（下記の像はタンパク質結晶を例としています）

• レーザー共焦点微分干渉顕微鏡：反射率0.5%程度の透明な固体表面上の1nm高さのステップを十分なコントラストで可視化できます．図４は，リゾチーム（タンパク質）結晶表面上の2.8nm高さのステップの成長を直接観察したものです（ムービーはこちら [avi:36MB, mov:3MB, gif:16MB]）．
  
• 薄液層型全反射蛍光顕微鏡：任意の固体表面上で，蛍光ラベル化した個々の分子の挙動をその場観察することができます．図５は，リゾチーム（タンパク質）結晶表面上で，蛍光ラベルしたリゾチーム１分子の挙動を追跡した例を示しています（ムービーはこちら [avi:16MB, mov:6MB, gif:7MB]）．
  
• 雪・氷結晶表面上のステップの運動や不凍タンパク質分子の挙動などをその場観察するための，新たな光学顕微法の開発に現在取り組んでいます．
  
• 上記以外にも，光学顕微技術を用いた様々な共同研究に，積極的に取り組んでいます．

図４　レーザー共焦点微分干渉顕微鏡を用いて観察した，リゾチーム正方晶系結晶(101)表面上の単位分子ステップ（2.8nm高さ）．島の合体に伴いステップのコントラストが完全に消滅する（矢印）ことより，単位ステップと証明されます．	図５　薄液層型全反射蛍光顕微鏡を用いて観察した，リゾチーム(モデルタンパク質)結晶表面での蛍光ラベル化リゾチームの挙動．蛍光ラベル化分子が結晶−溶液界面上で拡散している様子が分かります．